米乐m6登录Adv Sci-单体药理if15+： 灯盏乙素调控

　　线粒体生物能量缺陷及其导致的葡萄糖代谢减退是神经病变的关键病理生理因素。然而，目前还没有发现特定的潜在分子可以通过调节线粒体代谢和修复线粒体损伤来治疗神经系统疾病。灯盏乙素（4,5,6-羟基异黄酮-7-葡萄糖醛酸）是源于灯盏花（Erigeron breviscapus）的一种黄酮类化合物，是灯盏花素片、灯盏细辛注射液、灯盏生脉胶囊等多种中药及复方的主要药效成分，已被证明在治疗脑血管和心血管疾病方面具有广泛的药理活性和临床效果。探究灯盏乙素发挥神经保护作用的机制和关键靶点能够更好的指导临床合理用药，对于中药的进一步开发具有重要价值。

　　2023年9月26日，中国医学科学院药物研究所张金兰研究员和蒋建东院士团队在Advanced Science（IF=15.1）发表题为“Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis”的文章。科学家们基于建立的靶向线粒体代谢及功能的药物药效评价方法，发现灯盏乙素可特异性靶向脑组织线-PDC轴调控线粒体有氧代谢，提升线粒体膜电位水平并降低线粒体损伤，对脑缺血大鼠的神经损伤具有保护作用。该研究成果为灯盏花类中药的脑神经保护作用的物质基础和机制提供了科学依据，为灯盏乙素的进一步开发应用奠定基础，也为基于线粒体靶标的神经保护作用药物开发提供了创新评价方法。

　　研究表明线粒体在神经退行性疾病中起着核心作用[1-3]。线粒体功能障碍已被认为是衰老、阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VaD）的共同致病机制[4-7]。众所周知，大脑需要ATP形式的持续能量供应，其中大部分能量来源于葡萄糖代谢，而在神经退行性疾病中，大脑糖代谢会发生进展性的、疾病特异性的恶化，导致能量供应产生问题[8]。因此从代谢变化角度来解释神经元损伤，并寻找可以补救线粒体能量供应的疗法具有重要研究价值[9]。丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）催化丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶Ａ和二氧化碳，连接糖酵解和三羧酸循环，是线粒体葡萄糖氧化过程中的关键代谢酶。其活性由丙酮酸脱氢酶激酶 1-4（PDK1-4）作用下的可逆磷酸化调节，PDK2-PDC 轴在线粒体有氧代谢中发挥着重要的调控作用。

　　慢性脑缺血（CCH）属于神经系统疾病一种常见病理状态，是由于慢性脑灌注下降导致的脑功能障碍临床综合征，灌注不足剥夺了大脑的两种重要营养物质，即氧气和养分，因此大脑遭受功能失调的能量代谢、线粒体功能受损、突触功能障碍和神经元变性/丧失，导致认知障碍和AD[10]。在这些病理生理过程中，线粒体功能障碍与CCH的发生和发展相关，并导致随后的神经病理变化[11]。

　　灯盏乙素（4,5,6-羟基异黄酮-7-葡萄糖醛酸）是源于灯盏花（Erigeron breviscapus）的一种黄酮类化合物，已被证明具有广泛的药理活性和治疗心脑血管疾病的临床应用[12]。前期团队研究发现SG可以调节γ－氨基丁酸（GABA）和谷氨酸能神经元中的神经递质代谢[13]。神经递质代谢与神经细胞的能量代谢密切相关，并且神经细胞和脑组织的功能极其依赖于线粒体功能，因此需要深入研究SG在机体能量不足时对细胞能量代谢的作用。

　　慢性脑缺血2VO模型是使用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，造成慢性前脑的低灌注状态，从而制备慢性脑缺血的动物模型。2VO模型已经成为目前研究慢性脑缺血最常用的模型，它在研究慢性脑缺血后的白质损伤、海马区神经元变性以及学习和记忆功能障碍、神经信号传递障碍等方面都起了重要的作用。本实验通过建立2VO大鼠模型，尼莫地平作为阳性对照研究SG对CCH的影响。本实验应用水迷宫实验、氧化应激测试和组织病理学分析来评估2VO模型的稳定性和SG的治疗潜力（图1A），水迷宫实验采用改良的Garcia JH法进行神经行为评分，评价指标包括逃避潜伏期、有效停留时间和目标穿越时间。神经行为评分显示假手术组和SG组均显著高于模型组，表明SG可减轻缺血脑组织的认知障碍（图1B-E）。HE染色显示模型组海马CA1区和纹状体区出现典型的神经病理改变，出现明显的细胞固缩、皱缩和染色消失（图1-I中箭头标记）。相比之下，这些特征在SG组中得到了显著改善。与假手术组比较，模型组SOD、GSH-Px明显降低，SG治疗后SOD、GSH-Px明显升高，MDA则相反（图1F-H）。上述生化指标的检测结果表明，SG对2VO模型大鼠的氧化应激损伤具有一定的调节作用。这些结果基本表明了SG对CCH的药效作用。

　　图1. SG能减轻慢性脑缺血引起的病理改变，改善认知功能障碍，降低氧化应激。A）评估2VO模型的稳定性和SG的治疗潜力的过程。B）水迷宫实验的逃避潜伏期。C）神经行为评估结果。D）水迷宫实验的有效停留时间。E）水迷宫实验的目标穿越时间。F-H）各组的氧化应激相关参数的评价。I）各组间脑组织的组织病理学（黑色箭头代表炎性小胶质细胞；白色箭头代表神经元萎缩；蓝色箭头代表细胞固缩）。通过配对双尾Student’s t检验，数据表示为mean ± SEM，*p 0.05，**p 0.01，*p 0.001，*p 0.0001，模型相对于对照组，#p 0.05，##p 0.01，#p 0.001，#p 0.0001，SG或尼莫地平相对于模型组。

　　线粒体在调节生物能量、生物合成和信号传导中具有细胞内稳态的独特功能。ATP产生的减少导致ATP依赖性离子通道如Na+/K+和Ca2+泵的功能受损。由于离子通道不能维持离子平衡，导致Na+和Ca2+净内流，K+跨质膜外流，从而增加了静息膜电位到阈值，导致神经元中不受调控的去极化，称为缺氧去极化。线粒体ROS水平检测结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的线粒体ROS水平显著增加，而SG治疗组相对于模型组ROS水平显著降低（图2A）。值得注意的是，SG和假手术组之间的线粒体ROS水平没有显著差异，表明SG可以有效地减轻CCH状态下的氧化应激。同时研究表明Na+-K+ ATP酶和Ca2+-Mg2+ ATP酶对ROS最敏感，从而改变ATP的产生，调节神经元内的离子浓度梯度，刺激动作电位的产生。与2VO模型组相比，SG治疗组和假手术组大鼠脑线粒体Na+-K+ ATP酶和Ca2+-Mg2+ ATP酶活性均显著升高。考虑到过量的ROS和氧化应激可能对线粒体造成损伤，我们通过荧光分光光度法检测线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放的情况，发现模型组mPTP开放明显，线+几乎同时释放（Rhod-2比率信号增加），线粒体膜电位的崩溃（JC-1比率信号降低）和线粒体体积增加（肿胀信号减少），并且用SG处理能够显著恢复这些变化（图2A）。

　　ATP的合成是通过线粒体电子传递链（ETC）和ATP合酶氧化磷酸化（OXPHOS）。通过分光光度法进行评估线粒体呼吸链复合体活性（图2A）。与假手术组相比，CCH模型组复合物活性明显降低，而SG治疗组复合物I、III、IV、V活性明显升高。结果表明，CCH可损伤线粒体复合体，SG可增强线粒体呼吸链复合体的活性。此外，线粒体呼吸链是ROS产生的主要场所之一，即使在生理环境下，复合物I和III也是自由基和ROS的主要贡献者，这与脑线粒体中ROS的测定一致，即SG可以减少ROS的大量产生，恢复线粒体呼吸功能和ETC复合物的活性。通过透射电子显微镜（TEM）观察海马CA1区、皮层、纹状体线粒体超微结构的变化，如图2B所示，在假手术组中，所有样品中的线粒体具有突出的嵴和完整的膜，而在CCH组中，线粒体肿胀，嵴断裂并向周围移动，SG组改善了线粒体损伤。这些结果表明，SG显着减少CCH诱导的线粒体损伤，通过调节线粒体的稳态和ATP的生产。

　　线粒体是细胞能量生产的主要场所，主要功能是产生能量和代谢产物，线粒体功能障碍是脑血管和心血管疾病的关键特征。为了揭示线粒体功能障碍和SG的调节作用，我们采用了无标记定量蛋白质组学和线VO模型大鼠脑组织进行了分析（图3A）。使用PotterElvehjem型玻璃Teflon匀浆器和紧密配合的Teflon研杵制备脑匀浆（10%，w/v），分离线粒体组分并通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化。同时，通过蛋白质印迹法（WB）来评估线粒体纯度，WB实验表明，分离的线粒体纯度高，胞质干扰小，适合线C）。此外，作者使用高分辨率质谱（MS）进行蛋白质组学数据采集和PEAKS软件中的自动计算分析，并在假手术、2VO模型和SG治疗组中总共检测到5449个蛋白质，其中在肽和蛋白质水平上FDR1%。然后，作者将定量的脑蛋白质组数据应用于MitoMiner 4.0，使用MitoCarta 2.0数据库和IMPI（版本Q2 2018）数据库搜索线粒体蛋白质，并将脑蛋白质组的大部分（1113种蛋白质）识别为属于线粒体来源。Venn图（图3B）说明了这些数据库的线粒体蛋白质鉴定标准。为了确定上调或下调，测量每组中五个独立样品之间的脑线粒体蛋白的平均峰强度，然后将它们的倍数变化（FC1.3）相对于-log p值（p 0.05）绘制在火山图中。在模型与假手术组之间以及SG与模型组之间鉴定了583和136个差异表达的线粒体蛋白（DEMP，p值0.05），其中分别有525和79个FC1.3的DEMP（图3D，E）。我们随后调查了这些DEMP如何影响CCH病理和SG效果在一个公正的方式。使用STRING、BioGrid、OmniPath、InWeb IM数据库富集分析所有DEMP的蛋白质相互作用（PPI），应用MCODE算法来识别密集连接的网络组件，并保留通过p值获得的三个最佳评分项作为相应组件的功能描述（图3F）。其中，MCODE_1和MCODE_2含有大多数DEMP（55和21种蛋白），均与OXPHOS及其上游TCA循环相关，分别占总数的34.2%和14.0%（图3G，H），证明CCH模型和SG对线粒体的影响主要与线粒体有氧能量代谢有关。此外，通过DAVID聚类分析的功能注释表明，模型与假手术组和SG与模型组的DEMP在电子传递、呼吸链、TCA循环、转运、糖酵解等生物过程中是一致的（图3I，J）。与对照组相比，模型组中脂质相关代谢途径的变化更丰富，而SG被发现主要富集在线粒体葡萄糖有氧代谢途径中，而不是脂质代谢途径。PPI富集分析显示，这些DEMP与线粒体有氧呼吸密切相。